A study on flavin-containing amine = Studio di ammino ossidasi flaviniche in arabidopsis thaliana

Abstract

Le poliammino ossidasi (PAO) sono enzimi FAD-dipendenti che ossidano le poliammine spermina (Spm) e spermidina (Spd) e/o i loro derivati acetilati a livello del gruppo amminico secondario. L'identità chimica dei prodotti di reazione delle PAO dipende dall'origine dell'enzima e riflette la modalità di ossidazione del substrato. In particolare, le PAO presenti nelle piante monocotiledoni, come la PAO di mais (ZmPAO), ossidano l'atomo di carbonio interno adiacente al gruppo amminico secondario della Spm e della Spd, con produzione di 1, 3-diamminopropano (Dap), perossido di idrogeno e di un'amminoaldeide ed in tale maniera partecipano ad una via catabolica terminale delle poliammine. Le PAO animali e le spermina ossidasi (SMO) ossidano, invece, l'atomo di carbonio esterno adiacente al gruppo amminico secondario della Spd o della Spm (o dei loro derivati acetilati) producendo rispettivamente putrescina (Put) o Spd, un'amminoaldeide e perossido di idrogeno ed in tale maniera sono coinvolte in una via di interconversione delle poliammine. In Arabidopsis thaliana, sono stati identificati cinque geni codificanti per PAO putative: l'At5g13700 (AtPAO1), l'At2g43020 (AtPAO2), l'At3g59050 (AtPAO3), l'At1g65840 (AtPAO4), e l'At4g29720 (AtPAO5). L'AtPAO1 e l'AtPAO5 presentano un'omologia di sequenza con la ZmPAO (la PAO vegetale maggiormente caratterizzata ed avente una localizzazione apoplastica) rispettivamente del 23% e del 25% ed una probabile localizzazione citosolica. L'AtPAO2, l'AtPAO3 e l'AtPAO4 presentano un'omologia con la ZmPAO del 23%, un'omologia fra loro che varia tra il 58% e l'85% ed una localizzazione perossisomale. Recentemente, è stato dimostrato che l'AtPAO1 è in grado di ossidare la Spm, ma non la Spd e che è coinvolta in una via di interconversione delle poliammine in maniera simile a alle PAO animali e alle SMO. Nel presente lavoro di tesi, è stato effettuato uno studio sulle proprietà biochimiche delle proteine ricombinanti AtPAO2 e AtPAO4 in seguito alla loro espressione eterologa in Escherichia coli. Tale studio ha dimostrato che le proteine ricombinanti AtPAO2 e AtPAO4 sono attive nei confronti della Spm e della Spd e che producono Spd dall'ossidazione della Spm e Put dall'ossidazione della Spd. Questi dati indicano quindi che queste due AtPAO hanno una modalità di ossidazione del substrato simile a quella dell'AtPAO1 e delle PAO e SMO animali e che sono coinvolte in una via di interconversione delle poliammine. L'esistenza di una via di interconversione delle poliammine in A. thaliana è stata dimostrata anche in vivo. Infatti, durante l'incubazione di protoplasti ottenuti da foglie di A. thaliana con Spd o Spm radioattiva è stato osservato un aumento della quantità di Put o Spd radioattiva. Tale aumento 2 risulta fortemente inibito in presenza di guazatina, un inibitore specifico delle PAO. Nel presente lavoro, è stato dimostrato anche che le proteine ricombinanti AtPAO1, AtPAO2 e AtPAO4 sono in grado di ossidare le poliammine non comuni termospermina (Termo-Spm) e norspermina (Nor-Spm), che sono state associate alla tolleranza agli stress. In particolare, è stato dimostrato queste poliammine non comuni sono per l'AtPAO1 dei substrati migliori rispetto alla Spm facendo ipotizzare che potrebbero essere i suoi substrati fisiologici. Questo dato è di fondamentale importanza se si considera che recentemente è stato identificato un gene (ACAULIS5) codificante per una proteina capace di sintetizzare la Termo-Spm dalla Spd e che piante di A. thaliana che presentano una mutazione in questo gene (acaulis5) mostrano dei difetti nell'allungamento dello stelo. In A. thaliana sono presenti altri quattro geni: l'At1g62830 (AtLSD1), l'At3g13682 (AtLSD2), l'At3g10390 (AtLSD3) e l'At4g16310 (AtLSD4) che codificano per proteine aventi un dominio ammino ossidasico. Queste proteine presentano anche un dominio SWIRM, che è generalmente presente nei complessi coinvolti nelle modificazioni della cromatina, ed hanno un'omologia di sequenza con la proteina umana HsLSD1 (KIAA0601) che varia dal 26 al 30%. È stato dimostrato che l'HsLSD1, che ha gli stessi domini funzionali delle AtLSD, catalizza la demetilazione ossidativa dell'istone H3 mono o dimetilato sulla lisina 4 e fa parte di complessi multiproteici importanti nella regolazione dell'espressione genica. Nel presente lavoro, in seguito ad espressione eterologa in E. coli è stata effettuata una parziale caratterizzazione biochimica della proteina AtLSD1, scelta come membro rappresentativo di questa famiglia genica, ed è stato dimostrato che questo enzima vegetale ha un'attività iston-demetilasica e presenta la stessa specificità di substrato della corrispondente proteina umana. Inoltre, dall'analisi del modello della struttura tridimensionale dell'AtLSD1, eseguito sulla base del cristallo dell'HsLSD1, è risultato un'elevato grado di conservazione delle strutture secondarie dell'HsLSD1 e dei residui facenti parte del sito catalitico e sono emerse alcune importanti differenze che suggeriscono che i partners molecolari dell'AtLSD1 possano essere differenti da quelli della proteina ortologa umana. Per effettuare un'analisi del profilo di espressione dei geni AtLSD, sono stati condotti degli esperimenti di RT-PCR dai quali è emerso che i livelli di espressione di tali geni risultano simili nei vari organi testati. Inoltre, allo scopo di approfondire l'analisi del profilo di espressione dell'AtLSD1, il promotore di tale gene è stato amplificato tramite PCR dal DNA totale estratto da foglie di A. thaliana ed è stato clonato in un vettore per l'espressione in pianta, mediata da Agrobacterium tumefaciens, a monte della sequenza codificante per la green-fluorescent protein (GFP) in fusione con la -glucuronidasi (GUS). In questo modo è stato ottenuto un costrutto AtLSD1 prom::GFP-GUS. Per individuare i geni regolati dall'AtLSD1 tramite analisi 3 microarray ed esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina è stato preparato un costrutto per la sovraespressione dell'AtLSD1 in A. thaliana. In particolare, la regione codificante per l'AtLSD1 è stata amplificata tramite PCR utilizzando primers sequenza-specifici disegnati in modo tale da permetterne il clonaggio in un vettore che guidi la sovraespressione delle proteine in pianta e per aggiungere all'estremità 3' una coda di 6 istidine che faciliti l'individuazione della proteina. Per isolare i complessi nei quali la proteina AtLSD1 è eventualmente coinvolta attraverso cromatografia di affinità, è stato preparato anche un costrutto per la sovraespressione della proteina in fusione con una coda FLAG-HA. Tutti i plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per trasformare il ceppo GV301 di A. tumefaciens ed i batteri trasformati sono stati al loro volta utilizzati per trasformare piante di A. thaliana. Per determinare i ruoli fisiologici svolti dalle AtLSD, mutanti inserzionali per ognuno dei quattro geni (Atlsd1, Atlsd2, Atlsd3 e Atlsd4) sono stati ottenuti da banche di semi di A. thaliana e sono stati analizzati. In particolare, per confermare la presenza dell'inserzione del T-DNA e per identificare le piante mutanti omozigoti per l'inserzione è stata effettuata un'analisi tramite PCR del DNA totale estratto dalle piante mutanti. In seguito, è stata eseguita un'analisi dettagliata del fenotipo dei mutanti Atlsd che ha evidenziato un fenotipo nel mutante Atlsd3 caratterizzato da un ritardo nella fioritura. Polyamine oxidases (PAOs) are FAD-dependent enzymes which oxidize the polyamines spermine (Spm) and spermidine (Spd) and/or their acetylated derivatives at the secondary amino group. The chemical identity of PAO reaction products depends on the enzyme source and reflects the mode of substrate oxidation. In particular, PAOs from monocotyledonous plants, such as maize PAO (ZmPAO), oxidize the carbon on the endo-side of the secondary amino group of Spm and Spd producing 1, 3-diaminopropane (Dap), H2O2 and an aminoaldehyde, and are considered involved in a terminal catabolic pathway of polyamines. Conversely, animal PAOs and spermine oxidases (SMOs) oxidize the carbon on the exo-side of the secondary amino group of Spd or Spm (or their acetylated derivatives) producing putrescine (Put) or Spd, respectively, in addition to an aminoaldehyde and H2O2, and are considered involved in a polyamine back-conversion pathway. In Arabidopsis thaliana, five putative PAO genes have been identified: At5g13700 (AtPAO1), At2g43020 (AtPAO2), At3g59050 (AtPAO3), At1g65840 (AtPAO4), At4g29720 (AtPAO5). AtPAO1 and AtPAO5 have a sequence homology of 45% and 25%, respectively, with ZmPAO (the so far best characterized plant PAO which has an apoplastic localization) and a predicted cytosolic localization. AtPAO2, AtPAO3 and AtPAO4 display an homology of about 23% with ZmPAO, an homology of 58-85% to each other and a 4 peroxisomal localization. Recently, AtPAO1 has been shown to oxidize only Spm and not Spd and to be involved in a polyamine back-conversion pathway similarly to the animal PAOs/SMOs. In the present work, a study on the biochemical properties of recombinant AtPAO2 and AtPAO4 expressed in Escherichia coli was performed. This study demonstrated that recombinant AtPAO2 and AtPAO4 are active towards both Spd and Spm and that produce Spd from Spm and Put from Spd. These data indicate that these two AtPAOs have a mode of substrate oxidation similar to that of AtPAO1 and animal PAOs/SMOs and thus that they are also involved in a polyamine back-conversion pathway. The existence of a polyamine back- conversion pathway in A. thaliana has been demonstrated also in vivo. Indeed, incubation of A. thaliana protoplasts with radiolabelled Spd or Spm resulted in the accumulation of radiolabelled Put or Spd, respectively, which was strongly reduced in the presence of the PAO-specific inhibitor guazatine. In the present work, it was also shown that recombinant AtPAO1, AtPAO2 and AtPAO4 are able to oxidize the stress related uncommon polyamines thermospermine (Thermo-Spm) and norspermine (Nor-Spm). In particular, it was shown that these uncommon polyamines are better substrates than Spm for AtPAO1, suggesting that these polyamines may be the physiological substrates of this enzyme. This is of great importance considering that a gene (ACAULIS5) encoding for a protein able to synthesize Thermo-Spm from Spd has been recently characterized in A. thaliana and the acaulis5 Arabidopsis mutant presents defects in stem elongation. In A. thaliana, four more genes have been also identified: At1g62830 (AtLSD1), At3g13682 (AtLSD2), At3g10390 (AtLSD3), At4g16310 (AtLSD4) encoding for proteins with an amine oxidase domain. These proteins bear also a SWIRM domain, which is usually present in chromatin-modifying complexes, and display a 26-30% sequence homology with human HsLSD1 (KIAA0601). HsLSD1, which has the same functional domains as the four AtLSDs, has been shown to catalyse the oxidative demethylation of mono- or dimethylated lysine 4 of histone H3 and to participate in multiprotein complexes important in the regulation of gene expression. In this work, partial biochemical characterization of AtLSD1, chosen as a representative member of this gene family, following expression in E. coli demonstrated that this plant enzyme has a demethylase activity with the same substrate specificity as the corresponding human protein. Modeling of the AtLSD1 three-dimensional structure, using the HsLSD1 crystal structure, evidenced a high degree of conservation of the HsLSD1 secondary structures and of the residues building up the catalytic site, but also some important differences which suggest that the AtLSD1 molecular partners are probably different from those of the human orthologue. To analyse the expression pattern of AtLSDs, RT-PCR experiments were performed which showed that the AtLSD1, AtLSD2, AtLSD3 and AtLSD4 transcripts are present at similar 5 levels in all organs tested. With the aim to go deeper into the AtLSD1 expression pattern, the AtLSD1 promoter was amplified by PCR from Arabidopsis total DNA and cloned in an Agrobacterium tumefaciens-based plant expression vector upstream of the sequence encoding green-fluorescent protein (GFP) in fusion with -glucuronidase (GUS). In this way, an AtLSD1 prom::GFP-GUS construct was obtained. Furthermore, to identify the genes regulated by AtLSD1 through microarray analysis and chromatin immunoprecipitation experiments, a construct for AtLSD1 overexpression in A. thaliana was prepared. Indeed, the coding region of AtLSD1 was amplified by PCR using sequence specific primers designed in a way to allow AtLSD1 cDNA cloning through the Gateway technology in a vector which guides overexpression of proteins in plant and to add at the 3 terminus of cDNA a sequence encoding for a 6-His tag to facilitate detection. To isolate the complexes in which AtLSD1 is eventually involved through a two-step affinity chromatography, a construct for AtLSD1 overexpression in A. thaliana in fusion with a FLAG-HA tag was also prepared. All the recombinant plasmids were used to transform the A. tumefaciens GV301 strain and the transformed bacteria were in turn used to transform A. thaliana plants. To determine the physiological roles of AtLSDs, insertional knock-out mutants for each one of the four AtLSD genes (Atlsd1, Atlsd2, Atlsd3 and Atlsd4 mutants) were obtained from A. thaliana seed banks and analyzed. In particular, PCR analysis of total DNA from mutant seedlings was performed to confirm the presence of T-DNA insertion and to identify the homozygous mutant plants for this insertion. Detailed phenotypic analysis of the Atlsd mutants was also performed which evidenced a delayed flowering phenotype for Atlsd3 mutant. Dott.ssa Valentina Spedaletti