Studio delle proprietà funzionali di una libreria peptidica a sequenza casuale : implicazioni per lo studio dell'origine della vita

Abstract

La scienza assume che la vita sulla Terra abbia avuto origine attraverso un processo spontaneo di autorganizzazione ed aumento di complessità a partire dalla materia inanimata. Diverse teorie sono state proposte per spiegare questo spontaneo aumento di complessità. Wächtershäuser identifica cicli metabolici privi di enzimi come il cardine alla base dell’ origine della vita; Kauffmann propone cicli di peptide auto-catalitici come il principale motore, mentre Cech individuò in molecole auto replicanti di RNA la struttura fondamentale del primo sistema con proprietà “viventi”. Al contrario, Luisi identifica nella struttura autopoietica dei sistemi viventi il principio primo, mentre Lancet enfatizza l’ereditarietà composizionale come caratteristica saliente dei sistemi viventi. Nonostante le differenze, tutte le teorie devono affrontare la stessa questione fondamentale: è il percorso di transizione alla vita univocamente determinato dalla legge della fisica e della chimica? Oppure è piuttosto il risultato della simultanea interazione di diversi fattori contingenti? La controversia tra determinismo e contingenza emerge con forza se si considera l'emergere di biopolimeri funzionale nel quadro di origine della vita. Infatti, l'intera architettura della vita si basa su biopolimeri così che l'eziologia dei biopolimeri rappresenta un problema cruciale nel settore della ricerca sull’origine della vita. La questione principale è come biopolimeri funzionale siano stati selezionati in condizioni pre- o protobiotiche. Infatti, il numero di sequenze teoricamente possibile cresce esponenzialmente al crescere della lunghezza raggiungendo rapidamente cifre astronomiche così che non è ragionevole assumere che l’intero spazio delle sequenze sia stato esplorato durante l’evoluzione prebiotica. Da questa osservazione nasce l’interrogativo di come siano stati selezionati biopolimeri funzionali in un contesto prebiotico. Vi sono forse principi chimico-fisici particolari che sottendono alla selezione di biopolimeri funzionali? O piuttosto l’evoluzione molecolare è il risultato dell’interazione di fattori contingenti? Nel tentativo di rispondere a queste domande una libreria di sequenze peptide completamente casuale è stata sintetizzata e studiata per le sue proprietà funzionali al fine di verificare la possibilità di isolare nuove sequenze funzionali che non presentassero omologie con quelle presenti in natura. La libreria è stata progettata senza vincoli strutturali o sequenza in modo che possa essere ragionevolmente considerata come omologa ad una popolazione di peptidi prodotta in condizioni prebiotiche. La strategia sperimentale adottata ha utilizzato la tecnica dell’evoluzione in vitro che permette di testare simultaneamente un numero consistente di sequenze diverse al fine di individuare quelle che soddisfano un particolare criterio di selezione. L’evoluzione in vitro mima l’evoluzione naturale tramite cicli iterativi di mutazione-selezione-amplificazione. Ci sono due requisiti fondamentali per applicare l’evoluzione in vitro: il primo è la possibilità di creare un legame diretto tra genotipo e fenotipo. Il secondo si basa sulla disponibilità di una idonea procedura di screening per selezionare le sequenze che soddisfano i criteri di selezione. In questo progetto di dottorato la connessione tra genotipo e fenotipo è stata ottenuta utilizzando la tecnica del phage display, mentre la capacità di legare un analogo dello stato di transizione (TSA) per la reazione di idrolisi di esteri ed ammidi è stata utilizzata come criterio di selezione. La probabilità di successo in un esperimento di evoluzione in vitro è direttamente correlata alla complessità totale della libreria ed alla robustezza del processo di selezione. Conseguentemente, la prima parte di questo progetto di dottorato è stata dedicata alla costruzione di librerie di DNA codificanti peptidi a sequenza casuale di 20 residui e all'ottimizzazione della tecnica del phage display. Infine si è proceduto allo screening di suddetta libreria per la capacità di legare il TSA vincolante peptidi in diverse condizioni chimiche. La costruzione di librerie peptidiche pone una serie di problemi tecnici che limitano la loro applicabilità, per ovviare a queste limitazioni un nuove vettore fagemidico è stato sviluppato per consentire la costruzione di librerie altamente degeneri e diverse. I risultati ottenuti sono riassunti qui di seguito: Complessità della libreria @ 108 Diversità della libreria > 70% Copertura dello Sequenza delle spazio @ 10-56 Un ulteriore problema inerente la tecnologia del phage display risiede nella eterogeneità della popolazione fagica. Tale eterogeneità limita severamente la porzione di spazio delle sequenze effettivamente esplorabile e riduce drasticamente la possibilità di trovare funzioni rare come quella catalitica. Per ovviare a questi limiti è stata condotta un’ottimizzazione del processo di produzione e purificazione dei fagi che garantisse l’omogeneità del prodotto. I risultati ottenuti sono riassunti qui di seguito: Rapporto tra fagi ricombinante e non ricombinante aumentato di un fattore 10 rispetto agli standard commerciali e di letteratura. Rapporto tra genotipo wild-type e genotipo ricombinante ridotto del 33% La libreria è stata quindi sottosta a screening per il legame al TSA in diverse condizioni chimica ed in particolare a diversi pH (da 4 a 10) e concentrazione di zinco (0 mm a 10 mm). per mezzo di 4 cicli iterativi di selzioneamplificazione (biopanning). Al contempo, le condizioni di selezione, forza ionica e concentrazione di detergente, sono state modulate per minimizzare il binding aspecifico. Infine, i tempi di incubazione ed eluizioni sono stati modificati nei diversi cicli di biopanning per favorire il ricupero di peptidi con costanti di affinità basse. Il sequenziamento di cloni selezionati ha rivelato la presenza di pattern conservati al N- e C-terminale e la presenza di residui acidi a valle della regione N-terminale. L’analisi delle sequenze non hanno evidenziato altri pattern conservati ad eccezion fatta di quelli sopramenzionati. L’allineamento delle sequenze ha evidenziato una distribuzione isotropica delle stesse nello spazio delle sequenze. Inoltre, i risultati mostrano come il legame all’aptene sia favorito a bassi pH e non sia influenzato dalla concentrazione di zinco. Questi risultati mostrano che è possibile recuperare selettivamente peptidi funzionali capaci di legare il TSA in diverse condizioni chimiche anche se emerge chiaramente che alcune condizioni (i.e. pH>4) risultano in una selezione non ottimale. Inoltre, l’analisi delle sequenze mostra una notevole eterogeneità dei peptidi selezionati che suggerisce che vi siano diverse famiglie di sequenze non omologhe capaci di legare il TSA. Nel loro complesso i risultati suggeriscono che biopolimeri funzionali diversi da quelli presenti in natura sono uniformemente distribuiti nello spazio delle sequenze a sostegno della teoria della contingenza.

Science assumes that life on Earth originated from inanimate matter by a gradual and spontaneous increase of molecular complexity. Several different theoretical frameworks have been proposed to account for the spontaneous emergence of life. Wächtershäuser identifies enzyme-free metabolic cycles as the pivotal system underpinning life’s origin; Kauffmann proposes autocatalytic peptide cycles as the primary motor, whereas Cech fostered the idea that RNA was the scaffold of the first living system. Conversely, Luisi emphases the autopoietic nature of life; whereas Lancet proposes composition inheritance as the foundation of life. Despite the differences, all theories must confront the same fundamental question: is the transition to life pathway determined univocally by the law of physic and chemistry? Or it is rather the result of the simultaneous interplay of different contingent factors? The controversy between determinism and contingency emerges forcefully when one considers the emergence of functional biopolymers in the framework of the origin of life. Indeed, the entire architecture of life relies on biopolymers so that the aetiology of biopolymers represents a major issue in the field of origin of life research. The main question is how functional biopolymers have been selected under pre- or protobiotic conditions. Indeed, the number of theoretically possible sequences quickly reaches astronomic figures as the length increases so that the correspondent sequence space could not have been sampled exhaustively during natural evolution even for short biopolymers. A straightforward question arises: how were biopolymers selected? Were these biopolymers the best ones ever possible? Or were they simply the outcome of contingency shaped by natural evolution? To tackle this question, a completely de novo random library of short peptides has been designed and tested for potential catalytic activity. The library has been designed with no sequence or structural constrains so it can be reasonably considered as a mirror image of a peptide population produced under plausible prebiotic conditions. The selection criterion was based on the ability to bind a transition state analogue of the ester and amide bond hydrolysis in order to asses the frequency and distribution in sequence space of functional peptides. The ultimate objective of this doctoral project was to investigate the catalytic properties of a random library of peptides in order to assess whether and to what extend functional biopolymers display catalytic function and how functional peptides are distributed in sequence space. Accordingly, the envisaged experimental strategy had to ensure the screening of a vast library of random peptide in order to explore effectively the sequence space. The choice fell on in vitro evolution which allows the simultaneous screening of a vast library of candidate peptides for a priori defined function without a prior knowledge. In vitro evolution mimicries natural evolution in a test tube by means of iterative cycles of mutation-selection-amplification. There are two fundamental requirements to carry out directed evolution: the first is the availability of physical link between the genotype and the phenotype. The second relies on the availability of a suitable screening procedure to enrich the initial peptide population of those sequences satisfying the selection criteria. In this doctoral project the phage display technique has been employed to ensure a physical link between the genotype and the phenotype, whereas the binding to a transition state analogue (TSA) for the ester and amide bond hydrolysis has been used as selection criterion. The likelihood of success in a in vitro evolution experiment is directly related to the total size library, as evaluating more sequences increases the chances of finding one with the desired properties. Accordingly, the first part of this doctoral project has been devoted to the construction of a DNA library encoding for random 20mer peptides and to the optimization of the screening technique. Subsequently, the designed library and the optimised screening technique have been used to select TSA-binding peptides under different chemical conditions. The selection of catalytic peptides from a random library of sequences has never been attempted before and poses a number of technical challenges due to technical difficulties related to short fragment cloning, short peptide expression and purification. To tackle these problems a novel multipurpose vector has been developed that allowed the cloning of short DNA fragment with >90% efficiency. The results obtained are summarised hereafter: Library complexity @108 Library diversity: >70% Sequence space coverage: 10-56 Phage display relies on the presentation of foreign peptides/protein on M13 phage capside whereas the correspondent gene is encapsulated within. One of the major bottleneck of phage display is the inefficient display of foreign peptides on the virion capside and the encapsulation of wild-type phage genome into the recombinant viral particles. These limitations severely affect the screening efficiency and ultimately reduced the sequence space coverage. To overcome these limitations, the phage display techniques has been optimised in order increase the ratio of phage displaying foreign peptides and minimize the ratio of wild-type genome encapsulation. The results obtained are summarised hereafter: recombinant : non-recombinant phage ratio increased 10-fold wild-type : phagemid ratio decreased 33% The random DNA library encoding for random peptides has been screened for binding to the TSA under different chemical condition with respect to pH (4 to 10) and zinc concentration (0 mM to 10 mM). Phage library has been subjected to 4 selections round of increasing stringency with respect to incubation time, wash condition (ion strength and surfactant concentration) and elution time. Sequencing of selected clones retrieved a highly conserved consensus sequence at the N- and C-terminus of selected peptide, no consensus sequence could be identified except for a conserved acid residues downstream the conserved Nterminal region. Sequences alignment shows that selected peptides are isotropically distributed in sequence space. In addition, recovery yield greatly changed under different chemical condition with highest recovery yield at pH 4 with suboptimal recovery at different pH. Finally, zinc concentration does not seem to affect TSA binding irrespective of the pH. These results show that is possible to selectively recover peptides binding to the transition state analogue (TSA) for the ester and amide bond hydrolysis reaction under different chemical environment although this results in a suboptimal selection under certain conditions. In addition, sequence analysis shows a remarkable heterogeneity of selected peptides that may suggest that multiple sequences are capable to perform binding. Although an enzymatic validation of results is required, results suggest that potentially functional sequences are evenly distributed in sequence space supporting the contingency theory.